Streptococcus thermophilus : validation d'un nouveau mécanisme de régulation par quorum sensing
Betty Fleuchot (betty.fleuchot@jouy.inra.fr)
Unité de Biochimie Bactérienne BIOBAC
Phénomène largement répandu chez les bactéries, la communication cellulaire de type quorum sensing (QS) est un mécanisme de régulation de l'expression des gènes via la densité cellulaire. A l'heure actuelle, ce type de communication cellulaire est essentiellement étudié chez les bactéries pathogènes où il contrôle des fonctions physiologiques en relation avec la virulence mais encore peu étudié chez les bactéries positives. Par conséquent, peu de fonctions physiologiques contrôlées par QS sont encore identifiées chez ce groupe de bactéries. Il est probable que parmi ces fonctions physiologiques certaines interfèrent sur des caractères technologiques de bactéries positives de type ferment. Chez Streptococcus thermophilus, un des deux ferments nécessaire à la fabrication du yaourt, une seule fonction physiologique connue est régulée par QS via un système à deux composants : la production de bactériocines.
Des données préliminaires ont permis au laboratoire de proposer, chez S. thermophilus, un nouveau mécanisme de régulation par QS via un couple phéromone/régulateur transcriptionnel SHP/Rgg et un transporteur d'oligopeptides Opp. Notre objectif est dans un premier temps de valider ce nouveau mécanisme sur un locus particulier en nous appuyant sur les différentes étapes que doit réaliser une phéromone. Dans un second temps, la fonctionnalité de ce mécanisme sera testée sur d'autres locus pour découvrir de nouvelles fonctions physiologiques contrôlées par QS.
Pour valider ce nouveau mécanisme, l'expression du gène codant la phéromone permettant l'activation du système (gène shp) a été mesurée dans différents mutants. Pour ceci, le couplage du promoteur Pshp à un système rapporteur lux a été réalisé. Cette fusion transcriptionnelle ainsi construite a été introduite dans des mutants ?shp, ?rgg et dans différents mutants de l'opéron opp. Une absence d'activité du promoteur a été observée pour les mutants ?shp et ?rgg. Les mesures de l'activité du promoteur Pshp dans les mutants ?opp sont encore en cours au laboratoire. Par ailleurs, des cocultures entre ces différentes souches ont également été réalisées. L'ensemble de ces résultats valide deux des quatre étapes de ce nouveau mécanisme de régulation par QS : la maturation ainsi que la sécrétion de la phéromone SHP.
A terme, après confirmation des dernières étapes (réimportation de la phéromone par Opp et interaction phéromone/régulateur transcriptionnel), nous espérons pouvoir proposer et contrôler de nouvelles fonctions liées à un caractère technologique afin d'améliorer l'utilisation de ce ferment lactique.
Mots clés : Streptococcus thermophilus, régulateurs transcriptionnels Rgg, communication cellulaire, quorum sensing.
Implication des systèmes à deux composants de Streptococcus thermophilus dans les réponses à des changements environnementaux, dont la co-culture avec Lactobacillus bulgaricus
Benoit Thevenard (benoit.thevenard@jouy.inra.fr)
INRA, Unité BIOBAC, Domaine de Vilvert, 78352 Jouy en Josas Cedex, France
Les systèmes de régulation de type systèmes à deux composants (TCS) constituent un des mécanismes essentiels qu’utilisent les bactéries pour percevoir, répondre et donc s’adapter à des changements environnementaux. D’un point de vue structural, les TCS sont constitués de deux composants: un « senseur » ou protéine histidine kinase (HK) ancrée ou non à la membrane qui s’auto-phosphoryle en réponse à un stimulus puis transfère son groupement phosphate au régulateur de réponse (RR), le deuxième composant. Celui-ci se comporte alors le plus souvent comme un régulateur transcriptionnel permettant une réponse physiologique adaptée. Actuellement, même si certains TCS ont été étudiés en détail, les signaux perçus et les fonctions régulées par la plupart de ces systèmes sont mal connues notamment les TCS des bactéries lactiques, pourtant étudiées depuis longtemps et de grand intérêt industriel.
Dans le cadre de ce projet, nous nous intéressons aux phénomènes de régulation, via les TCS, qui résultent des changements environnementaux rencontrés par Streptococcus thermophilus lors de son utilisation en technologie laitière (acidification du milieu, variations des nutriments pendant la croissance, présence d’autres bactéries comme Lb. bulgaricus dans le yaourt, changement de force osmotique, variations de température…). Afin d’explorer l’implication et le rôle des TCS de S. thermophilus, des mutants négatifs des « régulateurs de réponses » ont été construits pour 6 des 8 RR de la souche séquencée LMD9. Des suivis d’acidification du lait de chacun des mutants ont été réalisés via le système CINAC et leurs cinétiques de croissance caractérisées. Différents paramètres abiotiques (supplémentation en purines, en Mg2+) et biotiques (co-cultures S. thermophilus LMD9 / Lb. bulgaricus) ont été testés. Ainsi, en terme de cinétique d’acidification, deux des mutants ont une latence un peu plus longue que la souche sauvage et leur pH final après 20h de culture est plus élevé. Par ailleurs, alors que la pente d’acidification d’un autre mutant est 20 % plus faible que la souche sauvage, la présence de Lb. bulgaricus conduit à une stimulation de l’acidification proportionnellement plus marquée pour ce mutant que pour la souche sauvage.
Actuellement, nous nous focalisons sur le locus associé au mutant impliqué dans la croissance en lait et dans l’interaction avec Lb. bulgaricus par l’étude de son régulon (suivi de l’expression des gènes et analyse protéomique globale).
Mots clés: Streptococcus thermophilus- Systèmes à deux composants- interactions bactériennes- "response regulator"- histidine kinase
Influence des AGPI n-3 sur l'évolution du phénotype astrocytaire au cours du vieillissement : étude in vivo chez le rat et in vitro sur des cultures d'astrocytes.
Alizée LATOUR (alizee.latour@jouy.inra.fr)
Alizée Latour, G.Champeil-Potokar, S.Denis, S.Vancassel, I.Denis, M.Lavialle.
NuReLiCe. INRA, Jouy-en-Josas.
Le vieillissement cérébral se caractérise par une inflammation chronique à bas bruit qui contribuerait à la survenue de dommages cérébraux liés à l'âge et favoriserait l'apparition de neuropathologies telle que la maladie d'Alzheimer. Cette inflammation à bas bruit jouerait en particulier un rôle dans l'apparition de l'astrogliose associée à la perte des fonctions astrocytaires, régulatrices de l'homéostasie, contribuant ainsi au maintien de ce contexte inflammatoire. L'acide arachidonique (AA), de la famille des omégas 6, et l'acide docosahexaenoique (DHA) de la famille des omégas 3, tous deux présents dans les membranes astrocytaires, seraient respectivement à l'origine d'une cascade signalétique pro-inflammatoire et anti-inflammatoire, une fois libéré par les Phospholipases A2. Les dérivés du DHA auraient également un rôle neuroprotecteur. Il est admis dans la littérature que le ratio d'AGPI n-6/n-3 consommé, détermine le ratio d'AGPI n-6/n-3 dans les phospholipides des membranes des cellules cérébrales. Une alimentation déséquilibrée en oméga3 et oméga6, fréquente depuis plusieurs années dans les pays occidentaux contribuerait à favoriser la cascade pro-inflammatoire. Notre hypothèse est qu'un régime équilibré en AGPI n-6/n-3 pourrait retarder l'apparition de l'astrogliose et limiter ainsi les dommages cérébraux liés à l'âge. Afin de répondre à cette hypothèse, Nous avons comparé les marqueurs astrocytaires chez le rat jeune et le rat âgé, soumis à un régime carencé ou équilibré en AGPI n-3. L'étude porte sur un marqueur impliqué dans l'activation gliale (phospholipases A2), un marqueur de l'astrogliose (GFAP) et des marqueurs de la fonction astrocytaire (transporteurs du glutamate (GLAST) et Sérine racémase) impliqués dans la régulation de la synapse glutamatergique (associée au phénomène de mémorisation).
Résultats :
Les analyses faites sur l'impact du vieillissement sur le phénotype astrocytaire ont montré une activité des Phospholipases A2 plus importante (dans le cortex frontal) et une plus forte expression de la protéine GFAP (dans le cortex frontal et dans l'hippocampe), chez les rats âgés que chez les jeunes rats. Concernant les deux marqueurs de la fonction astrocytaire, la sérine racémase est significativement plus élevée des rats âgés (dans le cortex frontal).
Les premières études menées sur le régime alimentaire montrent que les rats âgés ayant reçu un régime carencé en oméga 3 expriment plus fortement la protéine GFAP (dans l'hippocampe) que ceux ayant reçu un régime équilibré en omégas 3. La sérine racémase est significativement plus élevée chez les jeunes rats carencés que chez les jeunes rats équilibrés en omégas 3.
Ces résultats confirment l'impact du vieillissement sur la fonction astrocytaire (astrogliose notamment) et suggèrent également un impact de la carence en omégas 3 sur ces cellules. Ces résultats devront être confirmés par d'autres techniques telle que la RT-PCR et l'immunohistochimie.
Etude des effets régulateurs potentiels des AGPI-3 sur les phospholipases A2 dans 3 types de cellules cérébrales en culture: astrocytes, neurones, cellule souches
Rojo RASOAMANANA (rojo.rasoamanana@jouy.inra.fr)
NuReLiCe. INRA, Jouy-en-Josas.
Dans les cellules du système nerveux central (neurones, astrocytes, ?), l'acide arachidonique (AA), principal AGPIn-6 constitutif des phospholipides membranaires (phosphatidylcholine, phosphatidylserine,?), est libéré par 2 isoformes spécifiques de phospholipases A2 : l'isoforme cytoslique (cPLA2) et celle sécrétée (sPLA2). L'acide arachidonique libre est ensuite métabolisé par la cyclooxygénase COX2 pour synthétiser des prostaglandines pro-inflammatoires (PGE2,?) médiateurs de l'inflammation. L'acide docosahexaenoique (DHA), principal AGPIn-3 retrouvé dans les membranes de ces cellules, est quant à lui libéré par une autre l'isoforme iPLA2 de phospholipase A2 qui est également capable de libérer l'AA. Le DHA et ses dérivés (neuroprotectines dont NPD1,?) pourraient avoir des effets anti-inflammatoires et neuro-protecteurs (BAZAN, et al, 2006). Un déséquilibre d'apport nutritionnel en faveur des AGPIn-6 pourrait ainsi aggraver les réactions inflammatoires dans les neuropathologies (Alzheimer,?). A l'inverse, les AGPIn-3 exerceraient un effet neuroprotecteur.
L'objectif est d'étudier les effets régulateurs potentiels des AGPIn-6 (AA) et AGPIn-3 (DHA) sur les PLA2 (cPLA2, iPLA2) et sur la COX2 sur des cultures cellulaires de neurones, d'astrocytes et de cellules souches cérébrales.
Des cultures primaires d'astrocytes et de cellules souches issues de cerveau de rat d'un jour et des lignées humaines de neurones sont cultivées dans un milieu supplémenté ou non en DHA ou en AA. La supplémentation en AGPI est réalisée soit à court terme (30 minutes) pour mimer un effet de type signal, soit à long terme (>3jours) de façon à permettre une incorporation dans les membranes cellulaires. Les ARNm de la cPLA2, iPLA2 sont quantifiés par PCR quantitative et leurs protéines respectives sont mesurées par western blot pour chaque type cellulaire. La protéine COX2 est également quantifiée pour les lignées neuronales.
Dans nos résultats préliminaires, la déplétion à court terme en sérum de veau f?tal des astrocytes induit une augmentation de 7 fois la quantité de protéine iPLA2 comparativement aux cellules témoin non- déplétées. La supplémentation à court terme en DHA et en AA des cellules déplétées réduit au contraire ce taux d'iPLA2 qui retourne au niveau de celui des cellules témoin. Les premiers résultats suggèrent donc un effet « signal AGPI » (rapide) sur l'expression de la iPLA2 dans les astrocytes, sans différence entre AA et DHA.
L'analyse des effets à long terme (expression protéique et ARNm) est en cours dans les 3 types cellulaires.
Mots clés : astrocytes, neurones, cellules souches, PLA2, AGPI
Effets des AGPI et d'un glucocorticoïde sur la prolifération et la différenciation des cellules souches neurales
Emmanuelle Meffray (emmanuelle.meffray@jouy.inra.fr)
NuReLiCe. INRA, Jouy-en-Josas
De précédents travaux ont observé un effet stimulateur des acides gras polyinsaturés (AGPI) sur la neurogenèse adulte, effet comparable à celui de facteurs neurotrophiques. D'autre part, certaines études ont montré que le stress réduit la neurogenèse, et plus particulièrement la phase de prolifération des cellules souches neurales.
Dans ce cadre, nous étudions l'effet de deux AGPI très présents dans le cerveau, l'acide docosahexaenoic (DHA) et l'acide arachidonique (AA) et de la dexaméthasone (glucocorticoïde de synthèse).
A partir de cultures primaires de neurosphères, la prolifération et la différenciation en présence d'acides gras et/ou de dexaméthasone sont évaluées par western blot et immunocytochimie (marquage des protéines spécifiques des neurones et neurones matures, détermination de la proportion de neurones par rapport aux cellules gliales).
Est aussi quantifiée la phosphorylation des MAP kinases, protéines impliquées dans la croissance et la prolifération.
Enfin, le développement des neurites représente également un indicateur du degré de différenciation des neurones.
Mots-clés : Neurogenèse, Acides gras polyinsaturés, stress, MAP Kinases, Croissance des neurites
Influence des lipides alimentaires sur la sécrétion des caséines chez le rat
Souzan GHAZAL, Eric CHANAT, Sandrine TRUCHET
UR1196 Génomique et Physiologie de la Lactation (GPL), INRA de Jouy-en-Josas.
La glande mammaire (GM) des mammifères est un organe complexe dont le rôle est de produire le lait après la parturition. Le lait est un mélange de minéraux, vitamines, protéines et lipides permettant l'alimentation des petits jusqu'au sevrage. La fraction protéique du lait est essentiellement constituée par les caséines, synthétisées par la cellule épithéliale mammaire (CEM) en réponse à une hormone lactogène : la prolactine (PRL). La PRL entraîne également la production intracellulaire d'acide arachidonique (AA) qui pourrait accélérer le transport et/ou la sécrétion des caséines au pôle apical de la CEM. Cet effet sécrétagogue de la PRL n'est plus observé dans la GM d'animaux dont l'alimentation est dépourvue de lipides (régime lipidoprive, 1).
Le trafic intracellulaire et le processus d'exocytose reposent sur des échanges de membranes via des événements de fusion et de fission entre différents compartiments. En s'associant sous forme de complexes ternaires, les protéines SNAREs (Soluble NSF Attachment Receptor) constituent la machinerie minimale pour la fusion de membranes cellulaires (2, 3). De plus, l'AA est capable d'interagir avec ces protéines et ainsi de réguler positivement l'exocytose (4, 5). Notre hypothèse de travail est donc que la PRL pourrait réguler la sécrétion des caséines via l'action de l'AA sur les protéines SNAREs.
Nos résultats de RT-PCR montrent que la plupart des ARNs codant les protéines SNARE sont exprimés dans la GM de rate en lactation (L10) quel que soit leur régime alimentaire. Des expériences d'immunofluorescence indirecte sur des coupes de GM de rate en lactation (L10) nous ont permis de mettre en évidence la localisation intracellulaire de différentes protéines SNARE potentiellement impliquées dans la sécrétion des caséines.
Par la suite, les protéines SNAREs présentes dans la GM de rate en lactation seront mises en évidence par Western Blot quantitatif. La comparaison des régimes alimentaires témoin et lipidoprive nous permettra de savoir si la quantité de ces protéines varie avec la composition en lipides des régimes et donc des membranes cellulaires. Les protéines SNARE impliquées dans la formation du complexe d'exocytose des caséines seront identifiées par Western Blot et spectrométrie de masse après immunoprécipitation de ce complexe. A plus long terme, les régulations de la formation du complexe SNARE (PRL, AA) seront étudiées ainsi que la participation de certaines protéines partenaires (RABs, MUNCs et Synaptotagmines).
Références
[1] Ollivier-Bousquet et al. Deficiency of (n-6) but not (n-3) polyunsaturated fatty acids inhibits the secretagogue effect of prolactin in lactating rat mammary epithelial cells. J Nutr, 1993. 123(12):2090-100.
[2] Rothman & Orci. Molecular dissection of the secretory pathway. Nature, 1992. 355(6359):409-15.
[3] Sollner et al. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion. Nature, 1993. 362(6418):318-24.
[4] Latham et al. Arachidonic acid potentiates exocytosis and allows neuronal SNARE complex to interact with Munc18a. J Neuroche, 2007. 100(6):1543-54.
[5] Darios & Davletov. Omega-3 and omega-6 fatty acids stimulate cell membrane expansion by acting on syntaxin 3. Nature, 2006. 440(7085):813-7
Mots clés : glande mammaire, SNARE, exocytose, prolactine, acide arachidonique.
Détection de la Recombinaison Illégitime Assistée par l'Homologie chez Escherichia coli lors de la conjugaison
Jihane Amarir-Bouhram
Unité U.B.L.O Bât. 222
La recombinaison illégitime assistée par l'homologie (RIAH) a été décrite chez les bactéries naturellement compétentes telle que Streptococcus pneumoniae (Prudhomme et al., 2002), Acinetobacter sp. (de Vries and Wackernagel, 2002) et Pseudomonas stutzeri (Meier and Wackernagel, 2003). Ce mécanisme met en jeu la recombinaison homologue dans une région d'homologie entre un ADN donneur et receveur, et la recombinaison illégitime dans une région hétérologue. Ainsi, cet événement produit à la fois l'insertion d'un ADN entrant et la délétion d'une partie de l'ADN du génome receveur.
Une analyse systématique des régions variables chez E. coli a permis de mettre en évidence qu'une grande proportion de ces régions apparaît par une insertion accompagnée d'une délétion, qui pourrait être expliqué par la RIAH. Contrairement aux espèces où la RIAH a été précédemment observée, E. coli n'est pas naturellement compétente. Nous avons donc voulu tester si la RIAH pouvait se produire lors de la conjugaison, chez E. coli.
Une fréquence de RIAH de 10-9 a été observée dans notre système expérimental. Cependant, les caractéristiques de cette RIAH sont différentes de celles décrites jusqu'à présent. L'insertion d'ADN entrant n'est pas associée à une délétion mais à une duplication d'une petite séquence du chromosome receveur. De plus, il n'y a pas de microhomologie au site de recombinaison illégitime. Et enfin, dans un mutant recD, la fréquence de RIAH est diminuée d'un facteur 10, ce qui suggère que RecD est nécessaire au site de recombinaison illégitime.
En conclusion, la RIAH est détectable à faible fréquence lors de la conjugaison chez E. coli et elle présente des caractéristiques différentes de celle observée chez les espèces naturellement compétentes.
Mots clés : stabilité des génomes, transfert horizontal, conjugaison, recombinaison homologue et recombinaison illégitime.
Epigénétique et expression du gène /IGF2 /dans le placenta humain
Claire Louet
Biologie du Développement et Reproduction, UMR 1198
La protéine /IGF2/, pour Insulin-like growth factor 2, est un régulateur autocrine/paracrine important du développement foeto-placentaire. Localisé dans la région chromosomique 11p15.5, le gène /IGF2/ fait partie de la famille des gènes soumis à l'empreinte parentale. Son expression à partir de l'allèle paternel implique des processus moléculaires propres à l'empreinte mais aussi une régulation transcriptionnelle complexe qui utilise 5 promoteurs alternatifs à l'origine de 6 principales isoformes d'ARNm. De leur côté, les pathologies placentaires humaines comme la pré-éclampsie et le retard de croissance intra-utérin font état d'une fonction et d'une croissance placentaires inadéquates, rappelant le rôle du gène /IGF2/ qui apparaît très surexprimé dans les placentas issus de grossesses pathologiques.
Dans un premier temps, nous avons éliminé l'hypothèse d'un dysfonctionnement de l'empreinte au niveau du gène en montrant que ni son expression monoallèlique, ni la méthylation des régions différentiellement méthylées (DMR) du locus n'étaient altérées dans les placentas pathologiques. Ensuite, grâce à la mise à jour de la cartographie du gène /IGF2/, nous avons déterminé les niveaux d'expression ses 6 isoformes transcriptionnelles. Cette étude montre dans les placentas pathologiques une utilisation préférentielle de certains promoteurs parmi les 5 existants, en particulier le promoteur P0. Actuellement, nous poursuivons une étude de délétions du promoteur P0 dans un modèle de cellules soumises ou non à l'hypoxie (mimant le déficit en oxygène régnant dans les pathologies placentaires) afin de préciser les régions régulatrices du promoteur et l'implication de sites de fixation des facteurs HIF-1a et YY1 spécifique de celui-ci, en s'appuyant sur des recherches d'interaction avec le promoteur. Ce travail participera à comprendre les mécanismes qui régulent l'expression placentaire du gène /IGF2 /dans des conditions hypoxiques présentes dans les grossesses compliquées de pré-éclampsie et de retard de croissance intra-utérin.
Mots clés : pathologies placentaires humaines, /IGF2/, empreinte parentale, régulation transcriptionnelle.
Underfeeding affects IGF-1 and gene expression in genital tract tissues in high producing dairy cows
VALOUR Damien1, DEGRELLE Séverine1, MAROT Guillemette2, DEJEAN Sébastien3, DUBOIS Olivier1, HUE Isabelle1, GERMAIN Guy1, HUMBLOT Patrice4, PONTER AndrewA.1, CHARPIGNY Gilles1, GRIMARD Bénédicte1
1 UMR 1198, ENVA, CNRS, FRE 2857, Biologie du Développement et de la Reproduction, Institut National
de la Recherche Agronomique, 78350 Jouy en Josas, France;
2 INRA, UR337 Station de génétique quantitative et appliquée, Jouy-en-Josas, 78350, France;
3 Institut de mathématiques, Université Paul Sabatier, Toulouse, France;
4 Union Nationale des Coopératives d'Elevage et d'Insémination Animale, 13 rue Jouet, 94704 Cedex
Maisons Alfort, France;
A decline in fertility in high producing dairy cows has been observed in France since the '80s and is a cause of huge economic losses for dairy farmers. The decrease in fertility is linked to genetic (milk production potential) and environmental factors (alimentation). The negative energy balance observed during the postpartum period results from interactions between these factors. Previous studies have shown that this physiological state leads to modifications in gene expression profiles, particularly in the liver. The purpose of this project was to evaluate the influence of negative energy balance during the postpartum period on the gene expression profiles in the somatic tissues of the genital tract (oviduct, endometrium and corpus luteum). Prim' Holstein cows were randomly assigned to one of two treatment groups at calving:
control (100% requirements, n=4) and underfed (40% requirements, n=4). There was no difference between the groups at calving for: age, body condition score, previous milk yield, sire fertility index and milk index. Blood samples were taken regularly postpartum and plasma analysed for selected metabolites and hormones. Oestrus was synchronised 80d postpartum and tissue samples were taken from each pair of cows (control and underfed) 4, 8, 12 and 15d later. Metabolic and transcriptomic data were generated. Principal canonical pathways altered in the different tissues were highlighted and statistical correlations between gene expression and blood metabolites were calculated. The main modifications in gene expression were found in the oviduct and in the endometrium whereas; the corpus luteum was not affected. The biological pathways which were modified differentially by energy balance were involved in lipid metabolism (Fatty Acid Binding Protein 5 [FABP5]), but also in other biological pathways potentially linked to fertility (Lipase H [LIPH]). Using statistical correlation analysis the data were integrated into a model which highlighted the central role of Insulin-like Growth Factor 1 (IGF-1). In addition, IGF-1 appears to be a good predictor of energy balance in dairy cows.
Acknowledgments: This work received the financial support of the ANR GENANIMAL 03.P.406.
Key words: Fertility, dairy cows, energy balance, transcriptome, metabolism, genital tract, oestrus cycle
